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ヒト高分子アディポネクチンELISAキット

  • キット概要
  • キット構成
  • 測定方法
  • 性能
  • FAQ
Q1.キットの有効期間は?
A.本キットの有効期間は製造日より12ヵ月間です。なお、使用期限はキットの外箱に表示してあります。必ず2~8℃で保存してください。標準品の保存温度は、-20℃以下です。
Q2.キットの分割使用は可能か?
A.4回までの分割使用が可能です。残りの構成試薬は密閉して2~8℃で保存してください。(分割使用の場合は、プレートシールは必要分を切り取り使用してください。)
Q3.キットをプールしての使用は可能か?
A.抗体プレート以外は、同一ロットの構成試薬をプールして使用することが可能ですが、ロットの異なるキットを組み合わせて使用することはできません。
Q4.キット使用時の温度は?
A.必ず各構成試薬を20~30℃に戻してから使用してください。
Q5.測定可能な検体は?
A.ヒト血清中およびヘパリンNa採血管により採血された血漿が測定可能です。培養細胞等のサンプルは、参考値としてお取り扱い下さい。
Q6.血清の分離条件による影響および血清と血漿による測定値に差はあるか?
A.健常人4名で検討した結果、血清に比して血漿の測定値は、EDTA・2Naおよびクエン酸Na3.8%での採血において、低値になる傾向を認めました。ヒトの血液においては、血清およびヘパリンNa採血管による血漿は、測定値に影響がなく、使用に適しているものと思われます。
(単位:ng/mL)
検体 血清 血漿
分離剤入り EDTA2Na クエン酸Na3.8% ヘパリンNa
No.1 20.539 17.433 15.321 18.888
No.4 39.3 31.329 32.578 39.934
No.6 74.882 61.584 58.327 74.103
No.5 131.741 107.551 99.901 115.172
Q7.検体(未処理検体、希釈済検体)の保存方法は?
A.必ず凍結保存(-70℃以下が望ましい)してください。
Q8.検体(未処理検体、希釈済検体)の冷蔵(4℃)での安定性は?
A.2種類の値の異なる血清を用い、未処理(原血清)、前処理後101倍希釈、の状態で冷蔵安定性の評価を行ないました。未処理血清および101倍希釈血清は冷蔵状態でも7日間は測定値に変動を認めませんでした。いずれにしてもできる限り凍結保存してください。

検体 No.1

検体 No.2

Q9.検体(未処理検体、希釈済検体)の室温(25℃)での安定性は?
A.未処理血清および101倍希釈血清は室温状態でも8時間では、ほぼ測定値に変動を認めませんでした。いずれにしてもできる限り凍結保存してください。

検体 No.1

検体 No.2

Q10.検体(未処理検体、希釈済検体)の凍結融解による影響は?
A.未処理(原血清)、前処理後101倍希釈の何れの検体も、5回までの凍結融解で測定値の変動は認められませんでした。

検体 No.1

検体 No.2

Q11.前処理は、必要ないか?
A.血清中のnativeな状態の高分子体のアヂィポネクチンを測定するため前処理は必要ありません。
Q12.高値検体の希釈方法は?
A.前処理後、最終5100倍に希釈した血清を用い、検体希釈液でさらに希釈後測定してください。検体中のアディポネクチン濃度は、実測値に希釈倍率を乗じて産出してください。
Q13.インキュベーション温度の許容範囲は?
A.3種の値の異なる血清検体を用いてインキュベーション温度の影響を検討した結果、反応温度依存的な吸光度の変動が確認されましたが、下図に示すように20℃~30℃間ではほぼ同じ測定値が得られることが確認されました。

インキュベーション温度の許容範囲

Q14.標準曲線の作成法は?
A.標準曲線は、横軸に標準液の濃度を、縦軸に実質吸光度(各検体の吸光度から0ng/mLの吸光度を差し引いた値)をプロットし、両対数変換の二次回帰等を用いることにより作成します。
Q15.測定範囲は?
A.3.125~200.0ng/mLのHMWアディポネクチンを測定することが可能です。
Q16.再現性は?
A.3種類の管理試料(H、M、L)を同時に8回測定することで同時再現性試験としました。 また別に、3つの試料を5回繰り返して測定することで測定間再現性試験としました。さらに4名の異なる測定者により測定者間再現性試験を行ったとき、以下に示すように全ての試験の変動係数(CV)が10%以下と良好な結果を示しました。
測定内再現性試験【8重測定】(単位:ng/mL)
test-1 test-2 test-3 test-4 test-5 test-6 test-7 test-8 Mean SD CV(%)
管理試料L 19.615 19.160 19.449 18.954 19.532 19.990 21.302 22.033 20.004 1.089 5.44
管理試料M 63.422 60.726 56.546 59.820 61.288 60.516 58.511 70.796 61.453 4.276 6.96
管理試料H 154.268 144.550 134.128 143.208 147.404 146.720 157.592 152.392 147.533 7.350 4.98
測定間再現性試験【8重測定×6回】(単位:ng/mL)
test-1 test-2 test-3 test-4 test-5 Mean SD CV(%)
管理試料L 20.004 19.181 18.443 18.271 18.543 18.888 0.712 3.77
管理試料M 61.453 61.378 61.469 61.995 58.592 60.977 1.356 2.22
管理試料H 147.533 154.383 151.485 156.544 150.624 152.114 3.478 2.29
測定者間再現性試験 【8重測定×4名】(単位:ng/mL)
test-1 test-2 test-3 test-4 Mean SD CV(%)
管理試料L 20.371 20.505 21.651 20.860 20.847 0.575 2.76
管理試料M 64.335 69.914 73.423 65.018 68.172 4.292 6.30
管理試料H 164.992 184.059 178.430 160.946 172.107 10.924 6.35
Q17.添加回収試験は?
A.値の異なる3種類の管理血清に本キットで使用している標準品を添加後、HMWアディポネクチン濃度を測定することで回収率の評価を行いました。その結果、以下に示すように良好な結果を得られました。
検体 アディポネクチン(ng/mL) 回収率
添加量 理論値 実測値 (%)
L 12.5 22.004 21.355 97.0
25.0 34.504 35.254 102.2
M 12.5 44.544 44.865 100.7
25.0 57.044 55.756 97.7
H 12.5 90.685 96.433 106.3
25.0 103.185 100.929 97.8
Q18.希釈直線性は?
A.標準操作法に基づき希釈を行った3種類の101倍希釈管理血清を、検体希釈液を用いてさらに表の希釈率のとおり、希釈後測定した結果、以下に示すように良好な希釈結果が得られました。
アヂィポネクチン(ng/mL)
希釈率 L M H
1/128 0.4 0.9 1.7
1/64 0.7 1.3 3.1
1/32 1.0 2.3 5.9
1/16 1.5 4.5 11.4
1/8 2.7 8.9 22.1
1/4 5.1 16.1 42.4
1/2 10.1 32.4 84.5
1 22.3 60.0 167.6

希釈直線性

Q19.各種動物血清への反応性は?
A.各種動物血清を本キットで測定した結果、以下に示すように各種動物血清には交差反応性は、認められませんでした。
動物血清
動物種 OD450-650nm 平均値 実質吸光度
rabbit 0.033 0.034 0.000
0.035
FBS 0.037 0.040 0.000
0.042
sheep 0.044 0.043 0.000
0.041
Goat 0.050 0.046 0.002
0.041
chicken 0.041 0.040 0.000
0.038
cat 0.089 0.091 0.047
0.092
hamster 0.044 0.043 0.000
0.042
horse 0.042 0.046 0.002
0.049
Blank 0.040 0.044
0.047
Q20.Globularドメイン蛋白を検出することができるか?
A.固相抗体として使用しているモノクローナル抗体のエピトープ解析を実施した結果、N末端側を認識していることが判明しました。よって本ELISAキットはGlobularドメイン蛋白を検出できないものと推察しています。(社内検討結果)
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