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マウス/ラットアディポネクチンELISAキット

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  • 性能
  • FAQ
Q1.キットの有効期限は?
A.本キットの有効期間は製造日より18ヵ月間です。なお、使用期限はキットの外箱に表示してあります。必ず2~8℃で保存してください。
Q2.キットの分割使用は可能か?
A.4回までの分割使用が可能です。残りの構成試薬は密閉して2~8℃で保存してください。(分割使用の場合は、プレートシールは必要分を切り取り使用してください。)
Q3.キットをプールしての使用は可能か?
A.抗体プレート以外は、同一ロットの構成試薬をプールして使用することが可能ですが、ロットの異なるキットを組み合わせて使用することはできません。
Q4.キット使用時の温度は?
A.必ず各構成試薬を22~28℃に戻してから使用してください。
Q5.測定可能な検体は?
A.マウス及びラット血清や脂肪細胞抽出液あるいは培養上清中のアディポネクチンが測定可能です。なお、標準品にはリコンビナントマウスアディポネクチンを使用しているため、ラットの測定値はマウスアディポネクチン当量として算出されます。
Q6.標準品、血清の凍結融解による影響は?
A.標準品(8.0~0.25ng/mL、0ng/mL)および、未処理検体(マウス、ラット血清、培養上清*を各々1例)、希釈検体(マウス血清10201倍希釈、ラット血清及び培養上清1111倍希釈を各々1例)を用いて5回までの凍結融解を繰り返したとき、測定値に影響は認められませんでした。 *培養上清 : 脂肪細胞に分化誘導させた3T3-L1細胞の培養上清

希釈検体安定性

原液検体安定性

Q7.検体(血清、培養上清及び希釈検体)の保存方法は?
A.必ず凍結保存(-70℃以下が望ましい)してください
Q8.検体(血清、培養上清及び希釈検体)の冷蔵(4℃)での安定性は?
A.未処理検体及び希釈検体共に冷蔵(4℃)で7日まで測定への影響は認められませんでしたが、できる限り凍結保存してください。

希釈検体安定性

原液検体安定性

Q9.検体(血清、培養上清及び希釈検体)の室温(25℃)での安定性は?
A.未処理検体及び希釈検体共に室温(25℃)で8時間まで測定への影響は認められませんでしたが、できる限り凍結保存してください。

希釈検体安定性

原液検体安定性

Q10.高値検体の希釈方法は?
A.前処理後、検体希釈液でさらに希釈後測定してください。検体中のアディポネクチン濃度は、実測値に希釈倍率を乗じて算出してください。
Q11.インキュベーション温度の許容範囲は?
A.22℃~28℃でほぼ同じ測定結果が得られます。

22℃~28℃の測定結果

Q12.標準曲線の作成法は?
A.標準曲線は、横軸に標準液の濃度を、縦軸に実質吸光度(各検体の吸光度から0ng/mLの吸光度を差し引いた値)をプロットし、両対数変換の二次回帰等を当てはめることにより作成します。
Q13.測定範囲は?
A.0.25~8.0ng/mLのアディポネクチンを測定することが可能です。また自社施設における最小検出限界は15.6pg/mLでしたので、必要に応じ標準液の希釈系列を延長し、低濃度領域を正確に測定することも可能です。
Q14.再現性は?
A.同時再現性試験として4種類の管理試料を同時に8回測定した時の変動係数(CV)は10%未満でした。また測定間再現性試験として同じ試料を6回繰り返して測定した時の変動係数(CV)は15%未満でした。さらに4名の異なる測定者により測定者間再現性試験を行ったとき、変動係数(CV)は10%未満でした。
測定内再現性試験【8重測定】(単位:ng/mL)
管理試料 test-1 test-2 test-3 test-4 test-5 test-6 test-7 test-8 Mean CV(%)
マウス高値試料 5.124 5.187 5.325 5.362 5.05 5.367 5.096 5.105 5.202 2.5
マウス低値試料 0.769 0.659 0.731 0.709 0.766 0.661 0.703 0.712 0.714 5.8
ラット高値試料 4.523 4.987 4.51 4.387 4.497 4.88 4.378 4.609 4.596 4.8
ラット低値試料 0.53 0.534 0.524 0.601 0.511 0.604 0.521 0.559 0.548 6.6
測定間再現性試験【8重測定×6回】(単位:ng/mL)
管理試料 test-1 test-2 test-3 test-4 test-5 test-6 Mean CV(%)
マウス高値試料 5.214 5.772 4.963 4.888 5.436 4.791 5.177 7.2
マウス低値試料 0.714 0.718 0.651 0.648 0.661 0.668 0.677 4.6
ラット高値試料 4.596 5.305 4.301 3.944 5.635 4.433 4.702 13.6
ラット低値試料 0.548 0.540 0.499 0.462 0.561 0.508 0.420 7.1
測定間再現性試験【8重測定×4名】(単位:ng/mL)
管理試料 test-1 test-2 test-3 test-4 Mean CV(%)
マウス高値試料 5.214 5.144 5.610 5.072 5.260 4.6
マウス低値試料 0.714 0.642 0.782 0.673 0.703 8.6
ラット高値試料 4.596 4.181 4.765 4.448 4.498 5.5
ラット低値試料 0.548 0.465 0.507 0.473 0.498 7.6
Q15.添加回収試験は?
A.以下のように良好な結果を得ています。
検体 (ng/mL) 回収率(%)
読み値 添加量 理論値 実測値
培養細胞 1.329 4.000
2.000
1.000
0.500
0.250
0.125
5.329
3.329
2.329
1.829
1.579
1.454
5.619
3.586
2.347
1.837
1.526
1.471
105.4
107.7
100.8
100.4
96.6
101.2
培養上清 0.665 4.000
2.000
1.000
0.500
0.250
0.125
4.665
2.665
1.665
1.165
0.915
0.790
4.844
2.702
1.563
1.143
0.924
0.793
103.8
101.4
93.9
98.1
101.0
100.4
マウス血清 0.264 4.000
2.000
1.000
0.500
0.250
0.125
4.260
2.264
1.264
0.764
0.514
0.389
4.319
2.169
1.172
0.705
0.489
0.383
101.4
95.8
92.7
92.3
95.1
98.5
ラット血清 1.235 4.000
2.000
1.000
0.500
0.250
0.125
5.235
3.235
2.235
1.735
1.485
1.360
5.177
3.245
2.174
1.755
1.487
1.334
98.9
100.3
97.3
101.2
100.1
98.1
Q16.希釈直線性は
A.4種類の検体を検体希釈液によって測定範囲内に収まるように希釈し、さらに2倍、4倍、8倍、16倍希釈後測定した結果、以下に示すように良好な希釈結果が得られました。

希釈結果

アディポネクチン(ng/mL)
希釈率 細胞抽出液 培養上清 マウス ラット
1
1/2
1/4
1/8
1/16
7.257
3.384
1.627
0.838
0.415
5.866
2.783
1.314
0.641
0.322
6.332
2.975
1.415
0.701
0.357
4.454
2.058
0.961
0.513
0.256
Q17.各種動物血清への反応性は?
A.交差反応性を示さない動物検体 下記動物血清を1111倍希釈した後、本キットを用いて測定した結果、何れの血清も測定範囲下限(0.25ng/mL)未満であることを確認しました。
動物種 希釈率 OD450-650nm 実質吸光度
Sheep ×1111 0.138 0.101
Porcine ×1111 0.035 -0.002
Carf ×1111 0.035 -0.002
FBS ×1111 0.036 -0.001
Chicken ×1111 0.035 -0.002
(Blank) 0.037 0.000
交差反応性を示した動物検体 ヒトおよびイヌ血清を表中に示す希釈率で測定した結果、血清中アディポネクチンを検出できることを確認しました。しかしながら本キットの標準品には、リコンビナントマウスアディポネクチンを使用しているため、それぞれの測定値はマウスアディポネクチン当量として算出されます。よって、本キットで得られるヒト血清の測定値は、ヒトアディポネクチンELISAキットの測定値とは異なります。
動物種 希釈率 OD450-650nm 実質吸光度 測定値
(ng/mL)
血中濃度
(μg/mL)
Human ×4444 1.529 1.492 4.270 18.976
Dog ×20402 1.410 1.373 3.846 78.466
Q18.マウス/ラットアディポネクチンの免疫抗原は?
A.マウス/ラットアディポネクチンの免疫抗原は、大腸菌で作成したリコンビナント蛋白を用いています。リコンビナント蛋白は、マウスの全長アディポネクチンで分子量は約27kDです。
Q19.アディポネクチンの血中での状態は?
A.マウス血中、および培養細胞におけるマウスアディポネクチンの存在様式が論文にて報告されています。
HEK細胞および3T3-L1細胞の培養上清中には、6量体と3量体の存在が確認されており、さらに高分子の多量体を形成している可能性もあります。同様に、マウス血清中においても6量体および3量体が確認されており、さらに高分子に多量体を形成している可能性があります。
Q20.3T3-L1の脂肪細胞分化誘導方法は?
A.ご参考までに弊社での培養条件は以下のとおりです。
1. 3T3-L1細胞を数継代、10%CS-DMEMで培養する(Stock cellを起こして直ぐの場合です)。
2. 24well 培養plateに上記培地で希釈調製した3T3-L1を、5,000 cells/well (500μL/well)の条件で播く。
3. 37℃、CO2インキュベーターで1週間そのまま培養する。
4. 1週間後以下の誘導用培地 (500μL/well)に培地交換する。
10%FBS-DMEM、100μg/mL IBMX(3-イソブチル-1-メチルキサンチン)、390ng/mL Dexamethasone、10μg/mL インスリン
5. 37℃、CO2インキュベーターで培養する。
上記培養条件で数wellを用意し、一定時間毎に培地をサンプリングしアディポネクチン濃度測定を行う。
IBMX, Dexamathasoneは和光純薬(株)から購入
インスリンはノボリンR注を使用
参考文献 Fasshauer,M. et al; FEBS letters,500,60-63,2001
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