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ヒトアディポネクチンELISAキット

  • キット概要
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  • 測定方法
  • 性能
  • FAQ
Q1.キットの有効期限は?
A.本キットの有効期間は製造日より12ヵ月間です。なお、使用期限はキットの外箱に表示してあります。必ず2~8℃で保存してください。
Q2.キットの分割使用は可能か?
A.4回までの分割使用が可能です。残りの構成試薬は密閉して2~8℃で保存してください。(分割使用の場合は、プレートシールは必要分を切り取り使用してください。)
Q3.キットをプールしての使用は可能か?
A.抗体プレート以外は、同一ロットの構成試薬をプールして使用することが可能ですが、ロットの異なるキットを組み合わせて使用することはできません。
Q4.キット使用時の温度は?
A.必ず各構成試薬を20~30℃に戻してから使用してください。
Q5.測定可能な検体は?
A.ヒト血清又は血漿や脂肪細胞抽出液又は培養上清です。
Q6.血清の分離条件による影響および血清と血漿による測定値に差はあるか?
A.健常人3名で検討した結果、血清およびヘパリン血漿、EDTA血漿間では顕著な差は認められませんでした。クエン酸血漿では値が低目に出る傾向があるため使用できません。また、全血も使用できません。
(単位:ng/mL)
検体 血清 血漿
凝固促進剤 凝固促進剤
+分離剤
ヘパリン クエン酸 EDTA-2Na
1 3.234 3.422 3.136 2.766 3.304
2 1.941 2.157 2.036 1.539 1.744
3 1.275 1.289 1.206 0.990 1.127
Q7.検体(未処理検体、前処理済検体)の保存方法は?
A.必ず凍結保存(-70℃以下が望ましい)してください。
Q8.検体(未処理検体、前処理済検体)の冷蔵(4℃)での安定性は?
A.2種類の値の異なる血清を用い、未処理(原血清)、前処理済100倍希釈、最終5100倍希釈の状態で冷蔵安定性の評価を行ないました。未処理血清および前処理済5100倍希釈血清は冷蔵状態でも7日間は測定値に変動を認めませんでしたが、前処理済100倍希釈血清は徐々に測定値が低下する傾向を示していますので、加熱調製後は速やかに5100倍まで希釈してください。いずれにしてもできる限り凍結保存してください。
Q9.検体(未処理検体、前処理済検体)の室温での安定性は?
A.未処理血清および前処理済5100倍希釈血清は室温状態でも8時間は測定値に変動を認めませんでした。前処理済100倍希釈血清は、徐々に測定値が低下する傾向を示していますので、加熱調製後は速やかに5100倍まで希釈してください。いずれにしてもできる限り凍結保存してください。
Q10.検体(未処理検体、前処理済検体)の凍結融解による影響は?
A.未処理(原血清)、前処理済100倍希釈、最終5100倍希釈の何れの検体も、5回までの凍結融解で測定値の変動は認められませんでした。
Q11.前処理無しで測定可能か?
A.検体の測定には必ず前処理が必要です。
Q12.前処理にはヒートブロックが使用可能か?
A.検体の前処理は、ヒートブロック、水浴加温のいずれで行ってもかまいません。
Q13.前処理時間の許容幅は?
A.ヒートブロックを使用し、100℃の加熱を0~20分間行った結果、1分間以上の加熱でほぼ同じ測定結果が得られました。
(単位:ng/mL)
  前処理時間(分)
検体 0 1 3 5 7 10 20
No.1 0.083 0.985 0.918 0.901 0.931 0.899 0.976
No.2 0.270 5.192 5.443 5.104 5.202 4.405 4.744
Q14.前処理温度の許容幅は?
A.ヒートブロックを使用し、80~100℃の加熱を5分間行った結果、この温度範囲内でほぼ同じ測定結果が得られました。
(単位:ng/mL)
  前処理温度 (℃)
検体 80 85 90 95 100
No.1 1.057 1.047 1.044 1.122 1.040
No.2 5.830 5.655 5.870 6.145 5.814
Q15.各種検体に適した前処理法は?
A.
1. 血清、血漿:添付の前処理液をそのまま使用し、加熱処理後、検体希釈液で最終5100倍希釈し測定してください。
2. 培養上清、細胞抽出液:添付の前処理液を精製水で5倍に希釈後前処理液として使用してください。さらに最終100倍希釈後測定してください。
*なお細胞抽出用緩衝液 として10mM HEPES, 1mM EDTA, 1% NP-40, 100mM NaF, 10mM β-glycerophosphate, 1mM NaVO4, 20μg/mL PMSF, 10μg/mL Aprotine(pH7.4)を使用しました。本抽出用緩衝液で細胞を超音波破砕後、その遠心上清を測定に使用します。なお検討に使用した細胞抽出液の蛋白濃度は2mg/mLでした。
Q16.前処理後の希釈倍率は変更可能か?
A.
1. 血清、血漿は最終5100倍希釈が必要です。それ以下の希釈倍率(高濃度)では、正確な測定が行えません。5100倍以上の希釈であれば問題ありません。
2. 培養上清、細胞抽出液も同様に、最終100倍以上の希釈が必要です。
Q17.高値検体の希釈方法は?
A.前処理後、最終5100倍に希釈した血清を用い、検体希釈液でさらに希釈後測定してください。検体中のアディポネクチン濃度は、実測値に希釈倍率を乗じて算出してください。
Q18.インキュベーション温度の許容範囲は?
A.7種の値の異なる血清検体を用いてインキュベーション温度の影響を検討した結果、反応温度依存的な吸光度の変動が確認されましたが、下図に示すように20℃~30℃間ではほぼ同じ測定値が得られることが確認されました。

インキュベーション温度の影響を検討した結果

Q19.標準曲線の作成法は?
A.標準曲線は、横軸に標準液の濃度を、縦軸に実質吸光度(各検体の吸光度から0ng/mLの吸光度を差し引いた値)をプロットし、両対数変換の二次回帰等を用いることにより作成します。
Q20.測定範囲は?
A.0.375~12.0ng/mLのアディポネクチンを測定することが可能です。また自社施設における最小検出限界(Mann-WhitneyのU検定による有意差検定)は23.4pg/mLでしたので、必要に応じ標準液の希釈系列を延長し、低濃度領域を測定することも可能です。
Q21.再現性は?
A.2種類の管理試料(H、L)を同時に8回測定することで同時再現性試験としました。 また同じ試料を6回繰り返して測定することで測定間再現性試験としました。さらに4名の異なる測定者により測定者間再現性試験を行ったとき、以下に示すように全ての試験の変動係数(CV)が10%以下と良好な結果を示しました。
測定内再現性試験【8重測定】(単位:ng/mL)
test-1 test-2 test-3 test-4 test-5 test-6 test-7 test-8 Mean SD CV(%)
管理試料H 2.648 2.722 2.746 2.715 2.510 2.831 2.759 2.783 2.714 0.098 3.6
管理試料L 0.717 0.714 0.706 0.752 0.706 0.739 0.684 0.687 0.713 0.023 3.3
測定間再現性試験【8重測定×6回】(単位:ng/mL)
test-1 test-2 test-3 test-4 test-5 test-6 Mean SD CV(%)
管理試料H 2.714 2.803 2.934 3.203 3.001 2.921 2.929 0.169 5.8
管理試料L 0.713 0.699 0.776 0.737 0.786 0.731 0.740 0.034 4.6
測定者間再現性試験 【8重測定×4名】(単位:ng/mL)
test-1 test-2 test-3 test-4 Mean SD CV(%)
管理試料H 2.829 3.016 2.872 3.001 2.930 0.093 3.2
管理試料L 0.780 0.698 0.835 0.786 0.775 0.057 7.3
Q22.添加回収試験は?
A.濃度の異なる4種類の検体にヒトリコンビナントアディポネクチンを添加後、アディポネクチン濃度を測定し回収率の評価を行いました。その結果、以下に示すように良好な結果を得られました。
血清 アディポネクチン (ng/mL) 回収率
添加量 理論値 実測値 (%)
NO.1 0.000 0.273
0.625 0.898 0.840 93.5
1.250 1.523 1.439 94.5
2.500 2.773 2.698 97.3
NO.2 0.000 0.624
0.625 1.249 1.211 97.0
1.250 1.874 1.833 97.8
2.500 3.124 3.127 100.1
NO.3 0.000 0.937
0.625 1.562 1.587 101.6
1.250 2.187 2.207 100.9
2.500 3.437 3.476 101.1
NO.4 0.000 1.676
0.625 2.301 2.195 95.4
1.250 2.926 2.810 96.0
2.500 4.176 3.976 95.2
Q23.希釈直線性は?
A.標準操作法に基づき前処理を行った3種類の5100倍希釈血清を、検体希釈液を用いてさらに2倍、4倍希釈後測定した結果、以下に示すように良好な希釈結果が得られました。

希釈結果

(5100倍希釈結果を希釈率1と表示。)
アディポネクチン(ng/mL)
希釈率 No.7 No.21 No.22
1 2.309 4.985 0.943
1/2 1.128 2.692 0.453
1/4 0.552 1.284 0.239
Q24.各種動物血清への反応性は?
A.リコンビナントマウスアディポネクチンおよび前処理操作を行った各種動物血清を本キットで測定した結果、以下に示すように320ng/mLまでのマウスアディポネクチンおよび、各種動物血清には交差反応性は、認められませんでした。
マウスアディポネクチン
抗原濃度(ng/mL) OD450~650nm 平均値 実質吸光度
320 0.023 0.023 0.000
0.022
160 0.022 0.022 0.000
0.021
80 0.021 0.022 0.000
0.022
40 0.023 0.022 0.000
0.021
20 0.023 0.022 0.000
0.021
10 0.023 0.022 0.000
0.020
5 0.023 0.022 0.000
0.021
2.5 0.023 0.022 0.000
0.021
1.25 0.022 0.023 0.000
0.023
0.625 0.020 0.021 0.000
0.022
0.313 0.021 0.021 0.000
0.021
0 0.024 0.023 -
0.021
動物血清(前処理後測定)
OD450~650nm 平均値 実質吸光度
Mouse 0.025 0.027 0.000
0.028
Rat 0.028 0.033 0.003
0.037
Goat 0.032 0.035 0.005
0.037
Sheep 0.037 0.039 0.009
0.040
Porcine 0.021 0.024 0.000
0.027
Carf 0.028 0.032 0.002
0.036
FBS 0.029 0.029 0.000
0.033
(Blank) 0.026 0.030
0.033
Q25.Globularドメイン蛋白を検出することができるか?
A.固相抗体として使用しているモノクローナル抗体のエピトープ解析を実施した結果、N末端側を認識していることが判明しました。よって本ELISAキットはGlobularドメイン蛋白を検出できないものと推察しています。(社内検討結果)
Q26.前処理後に白濁沈殿の見られるサンプルが多く見受けられ、沈殿のあるサンプルの吸光度が低い。前処理にできる白濁は何故か? 採血はEDTA、保管は凍結、採血から測定までは約10日
A.前処理液中の成分が十分に溶解しておらず正常に反応していないため、サンプルに白濁沈殿が生じたと考えられます。 前処理液に含まれる成分は冷蔵下では十分に溶解しません。 使用前に前処理液を室温まで戻して撹拌し、前処理液の成分を十分に溶解させてから使用してください。
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